細菌培養方法
1儀器:
K罩細菌過(guò)濾效率檢測儀、高壓蒸汽滅菌器、電子天平、生化培養箱、軌道式振蕩器、超潔凈工作臺、菌落計數器
蒸餾水、75%酒精、金黃色葡萄球菌ATCC 6538、胰蛋白酶大豆瓊脂(TSA)、胰蛋白胨大豆肉湯培養基(TSB)、蛋白胨水、酒精燈、90mm平皿、500ml錐形瓶
取一個(gè)干凈的500ml的錐形瓶,稱(chēng)取16g TSA,溶于400ml水中,包扎后放入高壓蒸汽滅菌器中滅菌(121℃-123℃,20min),滅菌結束后取出,待其冷卻至50℃-60℃時(shí),將液體培養基逐個(gè)倒25ml左右入無(wú)菌培養皿中,操作應在超潔凈工作臺上進(jìn)行,以酒精燈的火焰周?chē)鳛闊o(wú)菌區域,避免雜菌污染。
待培養基冷卻凝固后,將其倒置放入恒溫培養箱中,37℃條件下培養24h,將有菌落生長(cháng)的培養基舍棄不用,無(wú)雜菌生長(cháng)的取出備用,盡量現用現做,如不能盡快使用,應密封放在4℃冰箱內冷藏,可保存3-4天。
將金黃色葡萄球菌ATCC6538接種在已滅菌好的100mlTSB(胰蛋白胨大豆肉湯液體培養基)中,在37℃震蕩培養24h。
用無(wú)菌移液槍取出上述培養好的菌液1ml注入9ml一滅菌好的蛋白胨水中,混勻,一次逐級稀釋10倍,稀釋至10-7(根據菌種實(shí)際情況來(lái)判斷需要稀釋至多少),然后分別取10-5、10-6、10-7菌液各0.1ml接種到備TSA培養基上,每個(gè)稀釋稀釋倍數做少4組平行,用涂布棒沿同一方向涂抹均勻,(不要涂抹到培養皿的邊緣上),放入生化培養箱中培養,培養溫度(37±2)℃,培養時(shí)間(24±2)h。培養結束后用菌落計數器計數,根據稀釋倍數確定原始菌液的濃度。
計算公式:原始濃度=(A/V)*D
A為培養皿上的平均菌落數
V為接種液的體積
D為稀釋倍數
按照上述方法確定原始菌液的濃度后,用1.5%的蛋白胨水將上述培養物稀釋至約5*105cfu/ml。
TSB的制備:稱(chēng)取3gTSB, 溶于100ml水中,放入高壓蒸汽滅菌器中(121℃-123℃,20min)滅菌,冷卻后備用。
蛋白胨水的配制:稱(chēng)取1.5g蛋白胨溶于100ml水中,包扎,放入高壓蒸汽滅菌器中(121℃-123℃,20min)滅菌,冷卻后備用。
實(shí)驗結束后逐級取出培養皿并蓋上皿蓋,標記后倒置放入恒溫培養箱中,37℃培養24-48h.試驗中,陽(yáng)性對照組應進(jìn)行至少兩次實(shí)驗,終陽(yáng)性質(zhì)控結果取平均值。
培養結束后,將所有培養皿取出,使用菌落計數器進(jìn)行計數,并將每一級菌落數對應陽(yáng)性孔轉換表進(jìn)行轉換,轉換后的數值求和,即得出菌落總數,陽(yáng)性質(zhì)控值范圍應在(2200±500)cfu之間。
細菌過(guò)濾效率計算公式如下:
BFE=(C-T)/C*
式中:C為陽(yáng)性質(zhì)控平均值,T為實(shí)驗組菌落總和